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细菌脂多糖通过TLR-4通路抑制小鼠成骨细胞分化及基质矿化的分子机制研究

发布时间:2018-09-28

细菌脂多糖通过TLR-4通路抑制小鼠成骨细胞分化及基质矿化的分子机制研究

骨折为临床骨科最常见的疾病,骨折愈合主要分为诱导期、炎症期、软骨痂期、硬骨痂期和重建期,骨折愈合中阻碍任何一个环节均会影响骨折的愈合。骨折愈合参与的细胞较多,不同阶段均有不同细胞参与,骨折血肿和炎症期,局部组织在各种趋化因子的作用下,骨折断端出现未分化的间充质干细胞,淋巴细胞和巨噬细胞,肉芽组织降解激活骨折断端成骨细胞,和骨生成前体细胞,成骨细胞和前体细胞增殖分化,生成细胞外基质,参与骨折愈合;在骨痂反应期,由骨膜内生发层和骨髓基质内生成的骨原细胞和诱导骨原细胞发生软骨内化骨,并向骨系细胞分化。在软骨形成期,成纤维细胞参与合成和分泌胶原分泌钙盐等,同时软骨细胞增殖分化和软骨化骨逐渐成熟。在骨痂形成期,成骨细胞产生新骨基质,破骨细胞参与骨的改建。骨折愈合除了细胞参与外,还有各类胶原和细胞外基质蛋白参与,任何细胞和蛋白功能受阻,都可能影响骨折愈合。开放性骨折常伴有细菌感染,而细菌感染释放的毒素,会干扰或者损伤骨折愈合相关细胞的正常代谢和功能,从而阻断骨折愈合的过程,因此细菌感染是骨折不愈合或延迟愈合的主要的原因之一,骨折愈合的过程就是成骨细胞参与钙化并最终生成骨质的病理炎性修复过程,期间病原体感染可导致局部炎症介质的释放,最终引起免疫反应,导致成骨细胞坏死或者凋亡,造成成骨功能障碍,最终导致不愈合。细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是细菌内毒素的主要成分,包括特异性多糖,非特异性多糖和类脂A,其中类脂A是主要的毒性部分,而细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的特有结构,其也是细菌主要的致热源,有相关研究表明,细菌释放的脂多糖是导致开放性骨折不愈合的主要原因,脂多糖炎症过程如何引起局部的炎症反应,其反应通过何种通路影响成骨细胞,形成骨质的具体作用机制尚不清楚,国内外缺乏相关的研究,而该问题对于临床治疗骨折不愈合或者延迟愈合其意义重大。炎症反应是机体对于外界的侵害和损伤的一种正常的防御,其有益于正常的骨折愈合过程,但是骨折后大量炎症因子的释放就会导致成骨细胞不能成骨或者破骨细胞活化。有研究报道,炎症导致的骨折不愈合,主要是由于细菌脂多糖引起的成骨细胞炎症反应,例如白细胞介素-1,白细胞介素-6和活化因子配基(RANKL)释放,或者是诱导成骨细胞分泌破骨细胞激活因子,从而能诱导破骨细胞成熟和激活。但是对于细菌脂多糖如何介导成骨细胞内信号传导的机制尚不清楚。Toll样受体(Toll-LIKE RECEPTOR,TLR)是参与非特异性免疫的一类重要的蛋白分子,TLR是机体天然的监控器,可以监视各种不同的疾病分子模式,是机体抵抗感染的首要通道。TLR可以识别细菌脂多糖,从而诱导分泌促炎细胞因子。Toll样受体识别细菌脂多糖发挥炎症作用主要是通过Toll样受体信号传导的髓样分化因子(MyD88)依赖机制,其主要过程是,配体结合TLR后导致MyD88聚集在TLR的TIR结构域,聚集后髓样分化因子与IRAK相互作用,使其磷酸化,磷酸化后的IRAK与肿瘤坏死因子受体相关因子结合,最后介导炎症反应。也就是说细菌脂多糖通过TLR介导的髓样分化因子生成的炎症因子发挥着抑制成骨细胞成骨过程,但其具体机制如何尚不清楚。骨折发生后,在各种炎症因子和其他细胞因子的作用下,骨折附近骨髓的间充质干细胞分化发育成,成骨细胞,其转化和分化的过程调节非常精密复杂,其作用机制如何,近年来有相关报道,有学者发现,闭合性骨折断端runt相关的转录因子-2(Runx2)及骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)的水平增高,也有研究发现,如果实验动物敲除了runt相关的转录因子-2,其成骨细胞水平降低,骨折愈合困难,因此可以初步认为runt相关的转录因子-2作为启动成骨细胞分化的钥匙,有研究发现,runt相关的转录因子-2,信号通路的激活与骨形态发生蛋白-7(Bone morphogenetic protein,BMP)体激活导致的细胞内磷酸化相关,而前者正是形成骨钙蛋白,刺激成骨的关键因素。因此本研究针对感染导致骨不连,骨折不愈合,以小鼠成骨细胞为研究对象,推测细菌脂多糖通过Toll样受体对成骨细胞分化的影响,通过测量碱性磷酸酶的活性,骨基质骨化、碱性磷酸酶、骨钙蛋白和Runx2的表达,明确脂多糖对于成骨细胞分化和基质矿化的影响;同时通过核糖核酸干扰技术,进一步明确脂多糖TLR-4依赖通路对成骨细胞分化的影响。本文研究的成果可以为细菌感染导致的骨折不愈合,提供分子生物学基础,也为感染导致的骨折不愈合治疗及药物靶点的选择,提供新的思路,由于本文的结果可以直接指导临床预防骨折不愈合具有重要意义。目的:(1)培养小鼠成骨细胞系MC3T3-E1.(2)用不同浓度的脂多糖培养小鼠成骨细胞系MC3T3-E1,利用免疫蛋白印迹测量TLR-4蛋白水平。(3)用逆转录-PCR的方法测量,不同浓度剂量的脂多糖处理小鼠成骨细胞系MC3T3-E1中成骨标志物ALP,OCN and Runx2的mRNA水平的变化,从而分析脂多糖对于成骨细胞成骨功能影响的计量依赖性。(4)用不同浓度剂量的脂多糖作用于小鼠成骨细胞系MC3T3-E1,检测成骨细胞中碱性磷酸酶活性和基质骨化的计量依赖性,从而分析不同浓度的脂多糖对于成骨细胞,成骨作用的影响。(5)不同浓度的脂多糖作用于去除siRNA-TLR-4表达(对TLR-4特异的siRNA转染MC3T3-E1细胞)小鼠成骨细胞进行培养,利用Von Kossa法测量基质骨化程度,检测碱性磷酸酶的活性,并测量不同剂量的脂多糖对基因敲除成骨细胞细胞活性和凋亡的影响。方法:(1)细胞系、组织、处理方法小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞用ATCC配方Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM)培养基分离培养。细胞溶液中添加10%的胎牛血清,100 units/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素,放在5%CO2,37℃的加湿培养箱中进行培养。脂多糖(LPS)用苯酚从大肠杆菌0111:B4提取纯化,并溶解在含2%血清α-MEM溶液中。设置脂多糖干扰组时,我们用0,50,100,200,or 400ng/mL脂多糖分别培养浓度为85%的成骨细胞0,4,8,12,or 24h,为敲除TLR-4表达,将30or 60nM siRNA-TLR-4脂质体2000转染到成骨细胞,用任意序列的RNA作对照。(2)蛋白印迹分析细胞浆的蛋白用细胞裂解液提取,并辅以蛋白酶抑制剂。蛋白样品经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离,并转移到聚乙二烯硝酸纤维素膜上。然后非特异性结合位点的被5%脱脂牛奶阻断并在40C过夜,然后用TLR-4的兔多克隆抗体或a磷酸甘油醛脱氢酶在室温下孵育2h,然后接种用过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体在室温下封闭1h。最后,用化学免疫发光(ECL)检测系统检测特异性结合。TLR-4水平用其与GAPDH相对灰度值表示。(3) Von Kossa染色和碱性磷酸酶活性的测定为了观察脂多糖对小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞分化的影响,将细胞在含10%胎牛血清α-MEM中培养并用0、50、200或400ng/ml的脂多糖干扰。用Von Kossa染色法测量MC3T3-E1细胞基质矿化水平。通过碱性磷酸酶实验测量碱性磷酸酶的活性,将MC3T3-E1细胞碎裂,用2毫克蛋白浓度的细胞裂解液加入到测定缓冲液(1 mM氯化镁,50 mM Tris-HC1,pH 9.2)(同时加入2mM磷酸对硝基苯酚)在37℃孵育10min后,再用0.45 MNaOH终止,在420nm处用对硝基苯酚处理后,测量吸光度。我们用与对照组相比较相对值来表示碱性磷酸酶活性检测的结果(4)实时反转录PCR测量TLR-4,ALP,OCN和Runx2的水平用mRNA Isolation and Purification试剂盒从细胞中分离总mRNA,取1μgmRNA,用one-step SYBR Green PCR Kits试剂盒合成检测与TLR-4,ALP,OCN和Runx2配对链。聚合酶链式反应(PCR)TLR-4,ALP,OCN和Runx2的配对链的合成后将与分离的mRNA溶液混合,利用LightCycler 2.0系统进行检测。所有实验均重复三次。用甘油醛-3磷酸脱氢酶做参照,基因转录水平的相对量用2-ΔAct法测定。(5)MTT细胞活性检测细胞活性用MTT法进行测定。简要步骤为,将MC3T3-E1细胞分别放在含有0、50、100,200或400 ng/ml的脂多糖溶液中培养24h。同时设有空白对照组。加入20 μL终浓度为5 mg/mL的MTT,将细胞置于37℃培养4h。之后小心移除上清,每孔加入100ul二甲基亚砜,放置于摇床上震荡10分钟,充分溶解结晶,用移液器反复吹吸使晶体溶解。培养板放于37℃培养,溶解气泡后,用全自动定量绘图酶标仪(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)在570nm波长下测定,结果计算公式为(实验孔的A570)/(对照孔的A570)×100%。(6)细胞凋亡检测用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒,分析细胞凋亡的百分率。用MC3T3-E1细胞处理过的细胞在2000rpm下离心5min,然后用PBS洗涤两次,吸取250ul的2×Binding Buffer和250ul去离子水,混匀,接着将细胞悬浮于400μl1×Binding的缓冲液中,使浓度为1×105cells/mL,再加入5gLAnnexin V-FITC和碘化丙啶,上下颠倒混匀。处理过的细胞放于暗室进行5-15min放射处理,然后进行流动细胞计数分析,流式细胞仪参数调节(EX=488nmEm=530nm)检测细胞凋亡的情况,绿色银光采用FITC通道通常为FL2来检测,红色荧光通过P1通道一般为FL1来检测。统计学处理:全部数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析,多组间不同组别间差异比较采用方差分析,两组间比较采用双尾t检验,显著性水平设定为0.05,当P值小于0.05,差异具有统计学意义。结果(1)脂多糖能够促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞生成TLR-4为了研究脂多糖在成骨细胞分化中的作用,我们首先研究脂多糖干扰的小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞Toll样受体-4的水平。小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞分别于0、50、100、200或400ng/mL的脂多糖共培养发现,mRNA TLR-4的水平会随着脂多糖的计量的增大而升高,说明mRNA TLR-4与脂多糖呈计量依赖性,同时还验证了mRNA TLR-4的水平与处理时间的相关性,由实验结果得出小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞TLR-4 mRNA的水平在用200ng/mL脂多糖共培养4h后迅速提高,培养6h和8h,TLR-4 mRNA的水平维持到一定的高值,其中培养8h后达到峰值,与培养4h和6h组比较,差异具有统计学意义。为了研究不同浓度脂多糖共培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞中TLR-4蛋白表达水平与脂多糖浓度的相关性,同样用0、50、100、200or400ng/mL浓度的脂多糖分别与小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞培养,发现随着脂多糖计量水平的升高,TLR-4蛋白表达水平逐渐升高,且呈剂量依赖性,0、50、100、200or 400 ng/mL浓度脂多糖组间比较差异具有统计学意义,MC3T3-E1细胞TLR-4的水平在用200ng/mL脂多糖共培养4h后迅速提高,培养6h和8h,TLR-4的水平维持到一定的高值,其中培养6h后达到峰值,与培养4h和8h组比较,差异具有统计学意义。综上所述,不同浓度的脂多糖与MC3T3-E1细胞共培养,随着计量的增高和时间的延长,其TLR-4在mRNA水平和蛋白水平均提高,呈剂量和时间的依赖性。LPS抑制成骨细胞碱性磷酸酶活性和基质骨化为了探讨脂多糖对成骨细胞分化的影响,通过将脂多糖与小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞共同培养,检测成骨细胞基质骨化和碱性磷酸酶活性水平。研究显示,用0、50、100、200或400ng/ml的脂多糖处理成骨细胞MC3T3-E1,其细胞的碱性磷酸酶活性显著降低,不同浓度组间差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001),且呈剂量依赖性(P<0.05),用0、50、100、200或400ng/ml的脂多糖处理成骨细胞MC3T3-E1,其细胞的基质骨化水平显著降低,不同浓度组间差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001),且呈剂量依赖性(P<0.05),当200或400ng/mL脂多糖加入到MC3T3-E1成骨细胞培养,成骨细胞MC3T3-E1形成矿化点明显减少(P<0.01200 ng/ml的LPS或P<0.001 400 ng/ml的LPS,图2C),呈剂量依赖性(P<0.01)LPS对成骨细胞成骨标志物的影响碱性磷酸酶、骨钙素、Runx2是成骨细胞分化的标志物,碱性磷酸酶、骨钙素、Runx2水平的提高可表明成骨细胞分化成熟水平提高。运用实时定量PCR研究不同剂量的脂多糖与MC3T3-E1成骨细胞培养,碱性磷酸酶mRNA水平的调节规律,发现随着脂多糖浓度的提高,成骨细胞碱性磷酸酶mRNA水平显著性升高,其不同剂量组间差异具有统计学意义。尤其是当浓度大于100ng/ml时,碱性磷酸酶mRNA水平显著性下降,当浓度大于400ng/ml时,碱性磷酸酶mRNA水平最低。我们发现骨钙素水平与脂多糖计量关系是:随着脂多糖浓度的提高,成骨细胞骨钙素水平显著性下降,其不同剂量组间差异具有统计学意义。尤其是当浓度大于200ng/ml时,骨钙素水平显著性下降,当浓度大于400ng/ml时,骨钙素水平最低。研究发现Runx2水平与脂多糖计量关系是:随着脂多糖浓度的提高,成骨细胞骨Runx2的骨化点显著性下降,其不同剂量组间差异具有统计学意义。尤其是当浓度大于200ng/ml时,骨化水平显著性下降,当浓度大于400ng/ml时,固化点水平最低。4脂多糖对于核糖核酸干扰介导,敲除TLR-4成骨细胞分化的影响为了进一步探讨TLR-4在脂多糖诱导成骨细胞分化,抑制中发挥的作用,我们在小鼠成骨细胞MC3T3-E1中敲除TLR-4,用不同浓度的脂多糖进行共培养处理,检查基质骨化状态、碱性磷酸酶活性、骨钙素和Runx2水平。通过TLR-4-specific siRNAs转染小鼠成骨细胞MC3T3-E1后,成骨细胞TLR-4的表达显著性降低,基质骨化的水平显著性升高,骨钙素和OCN的水平也显著性的高于对照组,经统计学比较,差异具有统计学意义,p=0.012本部分从遗传学基因水平证实了TLR-4为脂多糖诱导成骨细胞分化的作用靶点。结论(1)我们成功培养小鼠成骨细胞系MC3T3-E1.(2)脂多糖促进了成骨细胞MC3T3-E1 TLR-4蛋白表达,且呈计量和时间的相关性。(3)用逆转录-PCR的方法测量,不同浓度剂量的脂多糖处理的成骨细胞系MC3T3-E1中成骨标志物碱性磷酸酶、骨钙素、Runx2的变化,脂多糖对于成骨细胞三种成骨功能标志影响存在计量依赖性,呈负相关。(4)用不同浓度剂量的脂多糖作用于成骨细胞系MC3T3-E1,检测成骨细胞中碱性磷酸酶活性和基质骨化的计量依赖性,同时测量了不同剂量对成骨细胞凋亡和活性的影响,脂多糖对于成骨细胞,成骨作用具有抑制反应,同时可以降低成骨细胞活性提高成骨细胞凋亡的比例。(5)敲除TLR-4的成骨细胞MC3T3-E1其基质骨化程度和碱性磷酸酶、OCNRunx2的mRNA水平增高,敲除TLR-4的小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞活性提高,细胞凋亡率降低。

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